Verwendung und Vorsichtsmaßnahmen für Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen
1) Wählen Sie ein geeignetes Ultrafiltrationsröhrchen.Beachten Sie, dass sich UF-Membranen in ihrer Toleranz gegenüber verschiedenen Chemikalien unterscheiden.Typischerweise können Ultrafiltrationsröhrchen mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10 kDa ausgewählt werden, wobei die Molekulargewichtsgrenze nicht größer als 1/3 des Molekulargewichts des interessierenden Proteins sein sollte, beispielsweise 35 kDa.Wenn das Molekulargewicht des Proteins von Interesse etwa 10 kD beträgt, kann ein Ultrafiltrationsröhrchen mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3 kD verwendet werden.
(2) Die frisch gekaufte Ultrafiltration ist trocken, wobei vor der Verwendung hochreines Wasser hinzugefügt wird und das Wasser einige Minuten lang vollständig durch die Membran, das Eisbad oder den Kühlschrank geleitet wird.Dann wird das Wasser, also die Proteinflüssigkeit, abgegossen und so viel hinzugefügt, je nachdem, welche Menge nicht höher ist als die weiße Linie am oberen Ende des Röhrchens.Der Vorgang ist einfach und das Ultrafiltrationsröhrchen muss vor der Zugabe der Proteinlösung auf Eis vorgekühlt werden.
3) Sowohl die Masse als auch der Schwerpunkt sollten das Gleichgewicht erreichen.Beachten Sie, dass die Rotationsgeschwindigkeit und die Beschleunigung nicht sehr hoch sind, da sonst die Ultrafiltrationsmembran direkt beschädigt wird.Die zentrifugale Ultrafiltration wurde gestartet (Zentrifuge auf 4 Grad vorgekühlt).Nachdem die Drehzahl verschiedener Zentrifugen in g umgerechnet wurde, war es anders.Die Beschleunigung der Zentrifuge wurde auf ein Minimum eingestellt, wodurch der Druck auf die Membran verringert wurde.Beachten Sie, dass Sie die Zentrifuge unbedingt verlassen müssen, nachdem die Zentrifuge ihre Zielgeschwindigkeit erreicht hat. Andernfalls können Sie beim ersten Mal ein Problem nicht lösen.Die Ausrichtung der Membran zur Spindel wurde gemäß den Anweisungen angepasst (Winkelgehäuse der Zentrifuge steht Membran zur Achse senkrecht).Im praktischen Einsatz ist die allgemeine Rotationsgeschwindigkeit niedriger als in der Anleitung angegeben, sodass die Lebensdauer des Zentrifugenröhrchens verlängert werden kann.
3) Sowohl die Masse als auch der Schwerpunkt sollten das Gleichgewicht erreichen.Beachten Sie, dass die Rotationsgeschwindigkeit und die Beschleunigung nicht sehr hoch sind, da sonst die Ultrafiltrationsmembran direkt beschädigt wird.Die zentrifugale Ultrafiltration wurde gestartet (Zentrifuge auf 4 Grad vorgekühlt).Nachdem die Drehzahl verschiedener Zentrifugen in g umgerechnet wurde, war es anders.Die Beschleunigung der Zentrifuge wurde auf ein Minimum eingestellt, wodurch der Druck auf die Membran verringert wurde.Beachten Sie, dass Sie die Zentrifuge unbedingt verlassen müssen, nachdem die Zentrifuge ihre Zielgeschwindigkeit erreicht hat. Andernfalls können Sie beim ersten Mal ein Problem nicht lösen.Die Ausrichtung der Membran zur Spindel wurde gemäß den Anweisungen angepasst (Winkelzentrifugengehäuse steht Membran zur Achse senkrecht).Im praktischen Einsatz ist die allgemeine Rotationsgeschwindigkeit niedriger als in der Anleitung angegeben, sodass die Lebensdauer des Zentrifugenröhrchens verlängert werden kann.
(4) Wenn es auf den verbleibenden 1 ml konzentriert ist, nehmen Sie 50 µl Pufferlösung, fügen Sie 10 µl Durchfluss hinzu und prüfen Sie, ob eine blaue Farbe vorliegt, um zu beurteilen, ob im Ultrafiltrationsröhrchen Protein fehlt.Wenn das Röhrchen undicht ist, gießen Sie die obere Schicht erneut ein und lassen Sie es in ein neues Röhrchen durchfließen, um die Ultrafiltration zu starten.Um genau festzustellen, ob Röhrchen übersehen wurden, zentrifugieren Sie vor dem Durchfluss 10 Minuten lang mit 5 mg ml BSA, lassen Sie es mit Proteinkleber oder dem Bradford-Rohöltest laufen und fahren Sie mit der Zugabe der restlichen konzentrierten Proteinlösung fort (die auf Eis funktioniert und verhindert, dass sich Proteine erhitzen), bis Das gesamte Konzentrat wurde hinzugefügt.Seien Sie während der Zentrifugation vorsichtig, wenn es zu einer Ausfällung von Proteinen kommt, die zum Verschluss des Röhrchens führt.Wenn es zu Ausfällungen kommt, stellen Sie fest, ob die spezifische Ursache der Ausfällung eine zu hohe Proteinkonzentration oder ein ungeeigneter Puffer ist.Ersteres kann durch gleichzeitige Ultrafiltration mehrerer Ultrafiltrationsröhrchen gelöst werden, wodurch die Konzentration verringert wird, und letzteres durch Austausch verschiedener Pufferlösungen, bis keine Ausfällung des Proteins mehr auftritt.
(4) Wenn es auf den verbleibenden 1 ml konzentriert ist, nehmen Sie 50 µl Pufferlösung, fügen Sie 10 µl Durchfluss hinzu und prüfen Sie, ob eine blaue Farbe vorliegt, um zu beurteilen, ob im Ultrafiltrationsröhrchen Protein fehlt.Wenn das Röhrchen undicht ist, gießen Sie die obere Schicht erneut ein und lassen Sie es in ein neues Röhrchen durchfließen, um die Ultrafiltration zu starten.Um genau festzustellen, ob Röhrchen übersehen wurden, zentrifugieren Sie vor dem Durchfluss 10 Minuten lang mit 5 mg ml BSA, lassen Sie es mit Proteinkleber oder dem Bradford-Rohöltest laufen und fahren Sie mit der Zugabe der restlichen konzentrierten Proteinlösung fort (die auf Eis funktioniert und verhindert, dass sich Proteine erhitzen), bis Das gesamte Konzentrat wurde hinzugefügt.Seien Sie während der Zentrifugation vorsichtig, wenn es zu einer Ausfällung von Proteinen kommt, die zum Verschluss des Röhrchens führt.Wenn es zu Ausfällungen kommt, stellen Sie fest, ob die spezifische Ursache der Ausfällung eine zu hohe Proteinkonzentration oder ein ungeeigneter Puffer ist.Ersteres kann durch gleichzeitige Ultrafiltration mehrerer Ultrafiltrationsröhrchen gelöst werden, wodurch die Konzentration verringert wird, und letzteres durch Austausch verschiedener Pufferlösungen, bis keine Ausfällung des Proteins mehr auftritt.
(5) Die ersten paar Schritte dienen der Konzentration des Proteins. Wenn der Puffer gewechselt werden soll, fügen Sie vorsichtig neuen Puffer hinzu (Ultrafiltration durch eine 0,22-um-Ultrafiltrationsmembran) zu etwa 1 ml Gesamtprotein und konzentrieren Sie ihn drei Mal lang erneut auf etwa 1 ml aufeinanderfolgende Male, wobei das endgültige konzentrierte Endvolumen von der gewünschten Proteinkonzentration abhängt, im Allgemeinen nicht mehr als 500 µl, aber auch innerhalb von 200 µl.Erreichen Sie dreimal 1000 × oder mehr, im Wesentlichen so viel Pufferwechsel, wie durch mindestens etwa 10 × Volumenanreicherung jedes Mal berechnet.
(5) Die ersten paar Schritte dienen der Konzentration des Proteins. Wenn der Puffer gewechselt werden soll, fügen Sie vorsichtig neuen Puffer hinzu (Ultrafiltration durch eine 0,22-um-Ultrafiltrationsmembran) zu etwa 1 ml Gesamtprotein und konzentrieren Sie ihn drei Mal lang erneut auf etwa 1 ml aufeinanderfolgende Male, wobei das endgültige konzentrierte Endvolumen von der gewünschten Proteinkonzentration abhängt, im Allgemeinen nicht mehr als 500 µl, aber auch innerhalb von 200 µl.Erreichen Sie dreimal 1000 × oder mehr, im Wesentlichen so viel Pufferwechsel, wie durch mindestens etwa 10 × Volumenanreicherung jedes Mal berechnet.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 09.11.2022