PCRist die Polymerase-Kettenreaktion, die sich auf die Zugabe von dNTP, Mg2+, Elongationsfaktoren und Amplifikationsverstärkungsfaktoren zum System unter der Katalyse der DNA-Polymerase bezieht, wobei die Eltern-DNA als Matrize und spezifische Primer als Ausgangspunkt der Verlängerung verwendet werden. Durch die Schritte Denaturierung, Annealing, Extension usw. kann der Prozess der In-vitro-Replikation von Tochterstrang-DNA, die zur Matrizen-DNA des Elternstrangs komplementär ist, schnell und spezifisch jede Ziel-DNA in vitro amplifizieren.
1. Hot-Start-PCR
Der Startzeitpunkt der Amplifikation bei der herkömmlichen PCR besteht nicht darin, die PCR-Maschine in die PCR-Maschine zu stecken, und dann beginnt das Programm mit der Amplifikation.Wenn die Systemkonfiguration abgeschlossen ist, beginnt die Amplifikation, was zu einer unspezifischen Amplifikation führen kann. Eine Hot-Start-PCR kann dieses Problem lösen.
Was ist eine Hot-Start-PCR?Nachdem das Reaktionssystem vorbereitet ist, wird der Enzymmodifikator bei hoher Temperatur (normalerweise über 90 °C) während der anfänglichen Erhitzungsphase der Reaktion oder „Heißstart“-Phase freigesetzt, so dass die DNA-Polymerase aktiviert wird.Die genaue Aktivierungszeit und -temperatur hängen von der Art der DNA-Polymerase und dem Hot-Start-Modifikator ab.Bei dieser Methode werden hauptsächlich Modifikatoren wie Antikörper, Affinitätsliganden oder chemische Modifikatoren verwendet, um die Aktivität der DNA-Polymerase zu hemmen.Da die Aktivität der DNA-Polymerase bei Raumtemperatur gehemmt wird, bietet die Hot-Start-Technologie großen Komfort bei der Vorbereitung mehrerer PCR-Reaktionssysteme bei Raumtemperatur, ohne die Spezifität der PCR-Reaktionen zu beeinträchtigen.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transkriptions-PCR) ist eine experimentelle Technik zur umgekehrten Transkription von mRNA in cDNA und deren Verwendung als Matrize für die Amplifikation.Das experimentelle Verfahren besteht darin, zunächst Gesamt-RNA in Geweben oder Zellen zu extrahieren, Oligo (dT) als Primer zu verwenden, Reverse Transkriptase zur Synthese von cDNA zu verwenden und dann cDNA als Matrize für die PCR-Amplifikation zu verwenden, um das Zielgen zu erhalten oder die Genexpression nachzuweisen.
3. Quantitative Fluoreszenz-PCR
Quantitative Fluoreszenz-PCR (quantitative Echtzeit-PCR,RT-qPCR) bezieht sich auf die Methode, dem PCR-Reaktionssystem fluoreszierende Gruppen hinzuzufügen, die Anhäufung von Fluoreszenzsignalen zur Überwachung des gesamten PCR-Prozesses in Echtzeit zu nutzen und schließlich die Standardkurve zur quantitativen Analyse der Vorlage zu verwenden.Zu den häufig verwendeten qPCR-Methoden gehören SYBR Green I und TaqMan.
4. Nested-PCR
Unter Nested PCR versteht man die Verwendung von zwei PCR-Primersätzen für zwei PCR-Amplifikationsrunden, wobei das Amplifikationsprodukt der zweiten Runde das Zielgenfragment ist.
Wenn eine Nichtübereinstimmung des ersten Primerpaars (äußere Primer) dazu führt, dass ein unspezifisches Produkt amplifiziert wird, ist die Wahrscheinlichkeit, dass dieselbe unspezifische Region vom zweiten Primerpaar erkannt wird und weiter amplifiziert wird, sehr gering Durch die Amplifikation durch das zweite Primerpaar wurde die Spezifität der PCR verbessert.Ein Vorteil der Durchführung von zwei PCR-Runden besteht darin, dass sie dabei hilft, ausreichend Produkt aus begrenzter Ausgangs-DNA zu amplifizieren.
5. Touchdown-PCR
Die Touchdown-PCR ist eine Methode zur Verbesserung der Spezifität der PCR-Reaktion durch Anpassung der PCR-Zyklusparameter.
Bei der Touchdown-PCR wird die Annealing-Temperatur für die ersten paar Zyklen einige Grad über der maximalen Annealing-Temperatur (Tm) der Primer eingestellt.Eine höhere Annealing-Temperatur kann die unspezifische Amplifikation wirksam reduzieren, gleichzeitig erschwert eine höhere Annealing-Temperatur jedoch die Trennung von Primern und Zielsequenzen, was zu einer verringerten PCR-Ausbeute führt.Daher wird die Annealing-Temperatur in den ersten paar Zyklen normalerweise so eingestellt, dass sie pro Zyklus um 1 °C sinkt, um den Gehalt des Zielgens im System zu erhöhen.Wenn die Glühtemperatur auf die optimale Temperatur gesenkt wird, wird die Glühtemperatur für die verbleibenden Zyklen beibehalten.
6. Direkte PCR
Unter direkter PCR versteht man die Amplifikation von Ziel-DNA direkt aus der Probe, ohne dass eine Nukleinsäureisolierung und -reinigung erforderlich ist.
Es gibt zwei Arten der direkten PCR:
Direkte Methode: Nehmen Sie eine kleine Menge Probe und geben Sie sie zur PCR-Identifizierung direkt zum PCR-Master-Mix.
Cracking-Methode: Nach der Probenahme die Probe zum Lysat geben, lysieren, um das Genom freizusetzen, eine kleine Menge des lysierten Überstands entnehmen und zum PCR-Mastermix hinzufügen, PCR-Identifizierung durchführen.Dieser Ansatz vereinfacht den experimentellen Arbeitsablauf, reduziert die praktische Zeit und vermeidet DNA-Verluste während der Reinigungsschritte.
7. SOE-PCR
Beim Genspleißen durch Overlap-Extension-PCR (SOE-PCR) werden Primer mit komplementären Enden verwendet, damit PCR-Produkte überlappende Ketten bilden, sodass in der anschließenden Amplifikationsreaktion durch die Verlängerung der überlappenden Ketten verschiedene Quellen einer Technik entstehen, bei der amplifizierte Fragmente überlappt werden und zusammengefügt.Diese Technologie hat derzeit zwei Hauptanwendungsrichtungen: Konstruktion von Fusionsgenen;ortsspezifische Mutation des Gens.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) verwendet umgekehrt komplementäre Primer, um andere DNA-Fragmente als die beiden Primer zu amplifizieren, und amplifiziert unbekannte Sequenzen auf beiden Seiten eines bekannten DNA-Fragments.
IPCR wurde ursprünglich entwickelt, um die Sequenz benachbarter unbekannter Regionen zu bestimmen, und wird hauptsächlich zur Untersuchung von Genpromotorsequenzen verwendet.onkogene chromosomale Umlagerungen, wie Genfusion, Translokation und Transposition;und virale Genintegration werden heute ebenfalls häufig verwendet. Für die ortsspezifische Mutagenese wird ein Plasmid mit der gewünschten Mutation kopiert.
9. dPCR
Digitale PCR (dPCR) ist eine Technik zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen.
Zur Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen gibt es derzeit drei Methoden.Die Photometrie basiert auf der Absorption von Nukleinsäuremolekülen;Die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR (Echtzeit-PCR) basiert auf dem Ct-Wert, und der Ct-Wert bezieht sich auf die Zyklusnummer, die dem nachweisbaren Fluoreszenzwert entspricht.Die digitale PCR ist die neueste quantitative Technologie, die auf der Einzelmolekül-PCR-Methode zur Zählung von Nukleinsäuren basiert. Die Quantifizierung ist eine absolute quantitative Methode.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 13. Juni 2023